Das D2-Experiment

Das D2-Experiment Ein Modellsystem für in vitro Mutagenese und random-Evolution makromolekularer Strukturen

Abb.1 Frauke Christ und Christian Conrad

Institut für Fachschaftswissenschaften und angewandten Dilettantismus der Justus Liebig Universität Gießen, Heinrich-Buff-Ring 38, 35392 Gießen, Germany

Eingegangen am 01. 04. 1996; zur Veröffentlichung akzeptiert am 04. 06. 1996 ABSTRACT

Während fünfjähriger intensiver Studien konnte von uns erstmalig der Nachweis für eine Reverse Translatase (D2-fsbiol 96) erbracht werden. Das neuentdeckte Enzym zeichnet sich durch geringe Substratspezifität aber hohe Prozessivität sowie Thermostabilität aus. Das Heteromultimer, welches in der SDS-PAGE in mindestens vier Banden auf der Höhe eines 15, 17,5, 34,5 beziehungsweise 52 kDa Proteins läuft, zeigt ein Clustering von sieben hydrophoben Aminosäureresten, die eine hydrophobe Tasche bilden, in der drei Aminosäuren (AS) des Proteins Platz finden. Während der Katalyse bewirken reduktive Prozesse eine Partialdenaturierung des Substrates über einen Bereich von 21 AS-Resten. Die Reverse Translatase verfügt neben der Proteinbildungsstelle auch über ein Nucleotidbindungsmotiv, das in der gleichen hydrophoben Tasche zu finden ist.

Durch eine ungewöhnliche, von uns bereits beschriebene Konstruktion des katalytischen Zentrums (Christ und Conrad, 1994) wird eine starke räumliche Annäherung der beiden Substratspezies ermöglicht. Aktuelle Versuchsreihen (Ergebnisse nicht beigefügt) scheinen nun endlich den Beweis für unser bereits 1994 postuliertes Modell der revertierten bidirektionalen Translation zu liefern. Dadurch wird das zentrale Dogma der Molekularbiologie in Frage gestellt. Auch unsere vehementen Kritiker können angesichts dieser Ergebnisse ihre Augen nun nicht mehr vor dieser evolutiven Möglichkeit verschließen.

MATERIALIEN UND METHODEN

Bioreaktor

Der high-performance Bioreaktor Typ "liver sausage ®" wurde uns freundlicherweise von der Firma Herta FermTech zur Verfügung gestellt (Abb. 1).

Kulturmedium und Bakterienstamm

Das Vollmedium enthielt 500 mM Leberwurstreste (Herta), 0,1 mM Asche (halfzware shag; verschiedene Anbieter), 0,01 mM Kaffee (Dallmayr) und 50 mM Glucose (Südzucker). Als Starterkultur diente Chaobacter büchneri (Wildtyp). Inkubation erfolgte für 45040 Stunden bei wechselnden Klimabedingungen im S3-Labor der Fachschaft Biologie (Fensterbench). unter strikt anaeroben Bedingungen. Die Versuchsbedingungen wurden einmal wöchentlich von einer unabhängigen, subjektiven Expertenkommission streng überwacht.

Proteinaufreinigung

Proteinaufreinigung und -assays wurden nach Standardmethoden durchgeführt (Laemmli und Milka, 1977).

ERGEBNISSE

Aufgrund umfangreicher Versuchsreihen kann folgender Reaktionsweg als gesichert angesehen werden:
Die Reverse Translatase besteht aus drei wichtigen Untereinheiten: Die alpha-UE hat Proteinbindefunktion, wobei das Tyrosin 157 eine für die Bindung essentielle H-Brücke ausbildet. Eine Y157A-Mutante zeigt eine stark reduzierte Proteinbindung in vivo (Aachener Peptideprint; Conrad et al., 1995).

Die partielldenaturierende beta-UE zeichnet sich durch einen sogenannten Pernod-Effekt aus, bei dem durch eine hohe Ethanolkonzentration die Supersekundärstrukturen der Proteine aufgelöst werden und so die AS in einer pseudolinearen Kette vorliegen. Durch die schon bei den Azteken bekannte Droge ALKA kann dieser Effekt kooperativ antagonisiert werden (Selzer et al., 1969). Auf den teillinearisierten Proteinen bewegt sich die Reverse Translatase mit einer Geschwindigkeit von 3 AS/sec in Richtung Carboxyterminus, wobei dieser Vorgang einer linearen Diffusion gleicht (Abb. 1). Dabei beobachtet man einen sehr engen Kontakt zwischen Enzym und Substrat, der nach neueren Untersuchungen 3,756493 (stark gerundet) ConChri beträgt.

Die gamma-UE der Reversen Translatase hat Chaperonfunktion und bewirkt die Renaturierung des naszierenden Proteins.

Nucleotide werden über einen Kanaleffekt von der delta-UE an das katalytische Zentrum herantransportiert. Eine Vielzahl von Indizien deuten darauf hin, dass an diesem Transport Phospholipidcarrier beteiligt sind, die die Basen über einen Geranylgeranylpyrophosphat-Linker koppeln. Die Bewegung der Carrier im Kanal wird kaminsteigerähnlich über alternierende Myristilierungen realisiert (Abb. 1). Wir sprechen diesen Lipidcarriern eine tRNA-ähnliche Funktion zu.

Im katalytischen Zentrum werden die der sich dort befindenden AS komplementären Basen zu einer linearen Nucleotidkette polymerisiert.
Die Katalyse verläuft in einer der DNA-Polymerisation nicht unähnlichen Reaktion. Welches Triplett für die sich jeweils im katalytischen Zentrum befindliche AS verwendet wird, ist abhängig von Temperaturschwankungen, Lichteinfall bzw. -intensität und nationalen Feiertagen (Abb. 1).

Durch Verwendung jodsalzdotierter Uridylsäure zeigte sich ein vermehrter Einbau uracilreicher Codons in die naszierende Nucleotidkette (in Schaltjahren). Die so entstandene Nucleinsäure wird aus dem Protein nach dem Schussel-Schoss-Prinzip exportiert und im Cytoplasma von der DNA-Polymerase zu einer Doppelhelix komplementiert, was den Endpunkt der reversen Translation darstellt (Abb. 1).

DISKUSSION

Eine an uns häufig gerichtete Frage ist, wie sich ein solcher Prozess in der Evolution entwickeln konnte. Durch unsere aktuellen Forschungsergebnisse bekommt die bis Mitte dieses Jahrhunderts allgemein anerkannte These der erbcodierenden Funktion von Proteinen wieder die ihr zustehende zentrale Bedeutung. Angesichts unserer Ergebnisse wird es immer unverständlicher, wie Generationen namhafter Wissenschaftler einer Theorie anhängen konnten, die besagt, dass lineare, aus nur vier Grundbausteinen bestehende und somit wenig variable polymere Strukturen die Erbinformation beinhalten. Das von uns gewählte Modellsystem konnte zweifelsfrei zeigen, dass bei der reversen Translation ein immenses evolutives Potential für spontane, ungerichtete Mutationen existiert (Abb. 1).

Die Reverse Translatase selbst ist extrem variabel und bietet damit ein ideales Forum zur Anpassung an sich schnell ändernde Umweltbedingungen. Weiterhin eröffnen sich eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten auf dem Gebiet der Peptide-RTCR (Reverse Translatase Chain Reaction), die wir jedoch hier aus patentrechtlichen Gründen nicht darlegen können, da wir uns bereits in Verhandlungen mit der Firma Hoechst-Merckwuerdig befinden.

Update!!! Strukturvorschlag für die alpha-Untereinheit der Reversen Translatase:

Anmerkung:

Diese Arbeit wurde mit Drittmitteln der Fachschaft Biologie der JLU Gießen finanziert und muss deswegen als "Unsinn" gekennzeichnet werden.

REFERENZEN

Christ, F. and Conrad, C.: The Active Site of Reverse Translatase; Trends in Current Opinions, 1994, Vol. 21, No. 3 pp. 1122-1132
Conrad, C. and Christ, F.: Design of a Protein Capable of Doing Things it Shouldn´t Do; The Journal of Biochemical Junk, 1995, Vol. 16, No. 7, pp. 531-540
Conrad, C and Bahlsen, H.: Printing Peptides in Aachen; The Baker´s Flower, 1995, Vol 08/15, No. 5, pp. 4711-4719
Christ, F.: Characterization of Lipoprotein Carriers in Native Olive Oil; Oilily Journal, 1993, Vol. 12, No. 6, pp. 333-338
Cellular Nihilism, 1996, Vol. 21, No. 6, pp. 1234-1242
Laemmli, U. and Milka, K.: A Simple Guide to Protein Purification; The Housewife´s Journal, 1977, Vol 14, No. 3, pp. 12345-12355
Selzer, B.: Enzymology of the Drug ALKA in Boreal Forests; New England Magazine of Unimportant Things, 1969, Vol. 1, No. 1, pp. 112- 131
Baumann, B.: The Importance of Being Important; AStA News, 1996, Vol. daneben, No. comment, pp. 1-2
Ranseiher, K.: A Model for Resistance to Induced Stupidity; Amazing Discoveries, 1975, Vol. 31, No. 18, pp. 23-40